日本丰满白嫩BBWBBW_性做久久久久久久久_YY111111少妇无码理论片_亚洲国产精品

產(chǎn)品展示
PRODUCT DISPLAY
聯(lián)系方式

電話:
021-67610176傳真:

技術(shù)支持您現(xiàn)在的位置:首頁(yè) > 技術(shù)支持 > 什么是PCR?
什么是PCR?
  • 發(fā)布日期:2017-12-26      瀏覽次數(shù):6188
    • 定義

        聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR(英文全稱:Polymerase Chain Reaction),  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

      具體內(nèi)容點(diǎn)擊: 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),簡(jiǎn)稱PCR。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,簡(jiǎn)稱PCR)又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。

      發(fā)展簡(jiǎn)史

        人類對(duì)于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初,人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是,由于核酸的含量較少,一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana1971年zui早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是,當(dāng)時(shí)的基因序列分析方法尚未成熟,對(duì)熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn),寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動(dòng)合成階段,這種想法似乎沒有任何實(shí)際意義。   1985年,美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下,經(jīng)過兩年的努力,發(fā)明了PCR技術(shù),并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的*篇學(xué)術(shù)論文。從此,PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同,Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。   但是,zui初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟,在當(dāng)時(shí)是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初,Keohanog通過對(duì)所使用的酶的改進(jìn),提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后,Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶,使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用,使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué) 分析的根本性基石。在以后的幾十年里,PCR方法被不斷改進(jìn):它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定;從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kbDNA片段。到目前為止,PCR技術(shù)已有十幾種之多,例如,將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合,成為反轉(zhuǎn)錄PCR,將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。

      技術(shù)原理

        DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈,當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。   但是,DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活,因此,每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價(jià)格昂貴,制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個(gè)循環(huán)加酶,使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本,PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,并逐步應(yīng)用于臨床。

      工作原理

        類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火(復(fù)性)--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘,23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

      反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

        標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系:   10×擴(kuò)增緩沖液10ul   4dNTP混合物各200umol/L   引物各10100pmol   模板DNA0.12ug   TaqDNA聚合酶2.5u   Mg2+1.5mmol/L   加雙或三蒸水至100ul   PCR反應(yīng)五要素:參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2+)

      工作步驟

        標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步:   1.DNA變性(90-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA   2.退火(復(fù)性)(25-65℃):系統(tǒng)溫度降低,引物與DNA模板結(jié)合,形成局部雙鏈。   3.延伸(68-75℃):在Taq酶(在72℃左右*的活性)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3 端延伸,合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。   每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。如圖所示:   現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短,即使Taq酶活性不是*也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時(shí)在60-65℃間進(jìn)行,以減少一次升降溫過程,提高了反應(yīng)速度。

      反應(yīng)特點(diǎn)

        特異性強(qiáng)   PCR反應(yīng)的特異性決定因素為:  ?、僖锱c模板DNA特異正確的結(jié)合;   ②堿基配對(duì)原則;   ③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性;  ?、馨谢虻奶禺愋耘c保守性。   其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。   靈敏度高   PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞;在病毒的檢測(cè)中,PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。   簡(jiǎn)便、快速   PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。   對(duì)標(biāo)本的純度要求低   不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。

      循環(huán)參數(shù)

        1、預(yù)變性(Initial denaturation).   模板DNA*變性對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要,一般95℃加熱3-5分鐘。   2、引物退火(Primer annealing   退火溫度一般需要憑實(shí)驗(yàn)(經(jīng)驗(yàn))決定。   退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。   3、引物延伸   引物延伸一般在72℃進(jìn)行(Taq酶zui適溫度)。   延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短及所使用Taq酶的擴(kuò)增效率而定。   4、循環(huán)中的變性步驟   循環(huán)中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列*變性:   變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性,過短靶序列變性不*,易造成擴(kuò)增失敗。   5、循環(huán)數(shù)   大多數(shù)PCR25-35循環(huán),過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。   6、zui后延伸   在zui后一個(gè)循環(huán)后,反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸*,并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。   PCR-PCR常見問題

      電泳檢測(cè)時(shí)間

        一般為48h以內(nèi),有些于當(dāng)日電泳檢測(cè),大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。   假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶   PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及, PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。   模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時(shí)丟失過多,或吸入酚。⑤模 板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處 理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。   酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。   引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度 高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,對(duì)策為:①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長(zhǎng)度不夠,引物之間形成二聚體等。   Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。   反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul30ul、50ul?;?/span>100ul,應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul 后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。

      物理原因

        變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。   靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。   靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決:操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥唇?,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。   出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶   PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不*互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。   出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶   PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有:減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+ 度。增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。

      克隆PCR產(chǎn)物

        1)克隆PCR產(chǎn)物的*條件是什么?   *插入片段:載體比需實(shí)驗(yàn)確定。11(插入片段:載體)常為*比,摩爾數(shù)比1881也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí),或4℃過夜。在這2種溫度下,缺T-凸出端的載體會(huì)自連,產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求,為提高連接效率,需4℃過夜。   2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化?   如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶,不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶,可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高,這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆,而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。   3)如果沒有回收到目的片段,還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)?   A)涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。   如有菌落,表明氨芐失效,或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒,或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。   B)轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒,計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù),測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。   例如,將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后,用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜,產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為: 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。   鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA,用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,用1/10鋪板,共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為:   1000克隆X103次方) ng /鋪板1 ng DNA ug=106次方)cfu/ ug   轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用108次方)cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞   如沒有菌落或少有菌落,感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。   C)如用pGEM-T正對(duì)照,或PCR產(chǎn)物,產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑(用步驟108次方)cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞),表明載體失去T??赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶(M1801M1804M1794)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染,不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。   D)用pGEM-TpGEM-T Easy載體,連接pGEM-T正對(duì)照,轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞(108次方)cfu/ug,按照的實(shí)驗(yàn)步驟,可得100個(gè)菌落,其中60%應(yīng)為白斑,如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑沒有菌落或少有菌落,連接有問題。   4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,卻沒有回收到目的片段,實(shí)驗(yàn)出了什么問題?   A)連接用室溫保溫1小時(shí),能滿足大多數(shù)克隆,為提率,需4℃過夜。   B)插入片段帶有污染,使3`-T缺失,或抑制連接,抑制轉(zhuǎn)化。為此,將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合,再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù),插入片段需純化,或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-TpGEM-T Easy載體3`-T缺失。   C)插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段,因受UV過度照射,時(shí)有發(fā)生。UV過度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體,不利于連接,DNA必需重新純化。   D)帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A,后者是pGEM-TpGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料(TM042)。   E)高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定,在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排,如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排,需用重組缺陷大腸桿菌菌株,如SURE細(xì)胞。

      反應(yīng)五要素

        參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+   引物: 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。   設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:   ①引物長(zhǎng)度: 15-30bp,常用為20bp左右。   ②引物擴(kuò)增跨度: 200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。  ?、垡飰A基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。   ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。   ⑤引物3'端的堿基,特別是zui末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。  ?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點(diǎn), 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。   ⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無明顯同源性。引物量: 每條引物的濃度0.11umol10100pmol,以zui低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

      酶及其濃度

        目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng), 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)),濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。   dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性,使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后,以1M NaOH1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5,小量分裝, -20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50200umol/L,尤其是注意4dNTP的濃度要相等等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低),就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。   模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是: 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與氯fang抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本,可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。   Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

      PCR反應(yīng)條件的選擇

        PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。   溫度與時(shí)間的設(shè)置: 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,雙鏈DNA9095℃變性,再迅速冷卻至40 60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至7075℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。  ?、僮冃詼囟扰c時(shí)間:變性溫度低,解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的zui主要原因。一般情況下,93℃~94min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間,但溫度不能過高,因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性,就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。   ②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間,取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇zui適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:   Tm(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)   復(fù)性溫度=Tm-(510  在Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合, 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec,足以使引物與模板之間*結(jié)合。   ③延伸溫度與時(shí)間:Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性:   7080 150核苷酸/S/酶分子   70 60核苷酸/S/酶分子   55 24核苷酸/S/酶分子   高于90℃時(shí), DNA合成幾乎不能進(jìn)行。   PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時(shí)間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min;擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增,延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。

    魏經(jīng)理
    • 手機(jī)

      13224517959